一、涂片、干燥、固定、初染(媒染）、脱色、复染(1) 涂片：临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
(2)干燥 涂片建议在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
(3)固定 细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3——5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
(4) 初染：不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。
(5) 媒染：通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脱色：此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
(7) 复染：细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。
二、常用染料原液配制
一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g——5g；结晶紫7g——14g；碱性复红3g——7g。
三、常用的染色方法
1、单染色法 即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。
染液 ：①吕氏美兰液，美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成；②稀释石炭酸复红液 碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2、菌种：大肠埃希菌普通斜面培养物。
3、染色方法：于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4、结果：以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。同。
